Aritalab:Lecture/Biochem/Proteomics - Revision history

Adm at 06:06, 10 June 2011

2011-06-10T06:06:38Z

Adm: /* SRM, MRM */

2011-06-09T08:08:04Z

‎SRM, MRM

Adm: /* タンパク質のダイナミックレンジ */

2011-06-09T08:05:46Z

‎タンパク質のダイナミックレンジ

Adm: /* 定量法 */

2011-06-09T07:58:43Z

‎定量法

Adm: /* 細胞表面タンパク質の測定 */

2011-06-09T07:18:38Z

‎細胞表面タンパク質の測定

Adm at 06:50, 9 June 2011

2011-06-09T06:50:28Z

Adm: /* タンパク質のダイナミックレンジ */

2011-06-09T06:32:04Z

‎タンパク質のダイナミックレンジ

Adm at 21:34, 8 June 2011

2011-06-08T21:34:27Z

Adm: /* リン酸化タンパク質の測定 */

2011-06-08T07:53:27Z

‎リン酸化タンパク質の測定

Adm: /* リン酸化タンパク質の測定 */

2011-06-08T07:52:48Z

‎リン酸化タンパク質の測定

← Older revision		Revision as of 06:06, 10 June 2011
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	;糖タンパク質捕捉法		;糖タンパク質捕捉法
		+	血漿中のタンパク質は、アルブミンを除いて糖鎖で修飾されています。膜タンパク質も糖鎖修飾されています。したがって糖鎖の解析は大変重要です。
		+
	細胞に酸化剤を入れて細胞表面の糖を開環させてしまいます。開環で生じるアルデヒドにヒドラジド (hydrazide) が共有結合できるので、これにビオチン化して濃縮する手法です。シアトルにあるシステムバイオロジー研究所のR Aebersold らが開発しました<ref>Zhang H, Li XJ, Martin DB, Aebersold R (2003) "Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry" Nat Biotechnol 21(6):660-6</ref>。		細胞に酸化剤を入れて細胞表面の糖を開環させてしまいます。開環で生じるアルデヒドにヒドラジド (hydrazide) が共有結合できるので、これにビオチン化して濃縮する手法です。シアトルにあるシステムバイオロジー研究所のR Aebersold らが開発しました<ref>Zhang H, Li XJ, Martin DB, Aebersold R (2003) "Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry" Nat Biotechnol 21(6):660-6</ref>。

@@ Line 69: / Line 69: @@
 ショットガン方式で高く観測されるシグナルはSRMでも有用です。
 * 微量タンパク質で実測データが無い場合
-対象タンパク質に特異的で、翻訳後修飾を受けず、極性などが極端に偏らない部分配列を選びます。その際、以下の条件も効力します。
+対象タンパク質に特異的で、翻訳後修飾を受けず、極性などが極端に偏らない部分配列を選びます。その際、以下の条件も考慮します。
-: リジン、アルギニンの連続部分を含まない (トリプシンで消化されにくい)
+: &middot; リジン、アルギニンの連続部分を含まない (トリプシンで消化されにくいから)
-: メチオニンを含まない (酸化修飾を受けやすい)
+: &middot; メチオニンを含まない (酸化修飾を受けやすいから)
-: プロリン、グリシンを含む (切断されやすい)
+: &middot; プロリン、グリシンを含む (切断されやすいから)
 ===リン酸化タンパク質の測定===

@@ Line 23: / Line 23: @@
 ;1 &sim; 10<sup>3</sup> pg/mL
-* サイトカイン, インターロイキンなど (個人差が大きい 10-数百 pg/mL)
+* インターロイキンなどのサイトカイン<ref>免疫細胞が分泌する情報伝達用タンパク質を総称してサイトカインと呼ぶ。</ref>　 (個人差が大きい 10-数百 pg/mL)
 量の多い上位数種類のタンパク質を除いてもこの幅を克服することはできないため、いくつかの画分にわけて解析を進めます。精度を上げるには、ゲル電気泳動やイオン交換クロマトグラフィーを用いてタンパク質レベルの分離をおこなうことが重要です。

@@ Line 118: / Line 118: @@
 アレイは、全てのスプライシングバリアントを考慮できない、細胞内局在を考慮できない、生体内の環境とは一致しない、などの不具合はあるものの、免疫沈降法やＹ２Ｈよりは擬陽性は少ないと思われる。結合が見出されたらタンパク質インタラクトームのデータベースと比べてみることは重要。
-===定量法===
+==タンパク質の定量==
-;SILAC 相対定量法
+===SILAC 相対定量法===
 SILAC　(Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture) は定量精度が高く実用的です。
@@ Line 129: / Line 129: @@
 ただし、アルギニンが多いと生体内でプロリンに変換されるため、濃度を最適化することが重要。
-;ICAT 化学標識法
+===ICAT 化学標識法===
 ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) は細胞を培養する必要がないため、動物組織や臨床検体にも使えます。
@@ Line 136: / Line 136: @@
 # 混合してトリプシン処理したものを、LC-MS で測定
-バリアントが考案されています。
+===iTRAQ 法===
+ICATの進化系といえます。レポーター、バランサー、アミノ酸反応基を含み、質量の総計が同じになるように設計された iTRAQ試薬 4 種を使って標識します。（4つ以上でもＯＫです。）
-; iTRAQ 法
-レポーター、バランサー、アミノ酸反応基を含み、質量の総計が同じになるように設計された iTRAQ試薬 4 種を使って標識します。
 * <L+3>&minus; < R >&minus; peptide
 * <L+2>&minus; <R+1>&minus; peptide
 * <L+1>&minus; <R+2>&minus; peptide
 * < L >&minus; <R+3>&minus; peptide
-つのサンプルを標識後に混ぜて比較すると、MS解析では全てのラベルしたペプチドが単一のピークとして検出されますが、MS/MS解析をすると<A>から<A+3>までのレポーターイオンが観測され、定量データが得られます。ただし酵素消化後や濃縮をした後に標識するのが一般的で、精度は下がらざるをえない。
+つのサンプルを標識後に混ぜて比較すると、MS解析では全てのラベルしたペプチドが単一のピークとして検出されますが、MS/MS解析をすると<A>から<A+3>までのレポーターイオンが観測され、定量データが得られます。ただし酵素消化後や濃縮をした後に標識するのが一般的なので、精度は下がらざるを得ません。
 ;文献、参考
 <references/>

@@ Line 88: / Line 88: @@
 ===細胞表面タンパク質の測定===
 いずれの方法でも 200 から 300 の表面タンパク質を捕捉し、量的変動を解析することが可能です。
-細胞表面はウィルスや抗体が反応を起こす場になるため、発現量が一定以上あって外部刺激に応答する標的分子を探すことは抗体医薬の開発において重要です。とくにガンに対しては、抗体依存性細胞障害 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) を誘導してナチュラルキラー細胞にガン細胞を殺させる手法が注目されています。たとえば Her2 タンパク質は上皮増殖因子受容体ファミリーに属し、転移性乳癌で過剰発現する場合があります。そうしたレセプターが特定されれば、トラスツズマブ (Trastuzumab 商標名はハーセプチン) のような特異的抗体を設計してADCCを促進することでガン細胞を攻撃できます。
+細胞表面はウィルスや抗体が反応を起こす場になるため、発現量が一定以上あって外部刺激に応答する標的分子を探すことは抗体医薬の開発において重要です。とくにガンに対しては、抗体依存性細胞障害 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) を誘導してナチュラルキラー細胞にガン細胞を殺させる手法が注目されています。たとえば HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2) (別名 ERBB2) タンパク質は上皮増殖因子受容体ファミリーに属し、30%　の転移性乳癌で過剰発現しています。そうしたレセプターが特定されれば、トラスツズマブ (Trastuzumab 商標名はハーセプチン) のような特異的抗体を設計してHER2 をブロックし、ADCCを促進することでガン細胞を攻撃できます。トラスツズマブの場合は、p27遺伝子を活性化させ、細胞の増殖を抑えます。
 ; ビオチンラベル法

@@ Line 4: / Line 4: @@
 ==タンパク質のダイナミックレンジ==
-タンパク質の量比は組織によっても異なりますが、少なくとも血漿中では 10<sup>11</sup> もの差があります。血漿の 8 ％がタンパク質で、3000 種類以上が含まれています<ref></ref>。（血清は血液が凝固した後の水溶成分で、血液凝固因子が無く、血小板から出る成長因子を含む。）
+タンパク質の量比は組織によっても異なりますが、少なくとも血漿中では 10<sup>11</sup> もの差があります。血漿の 8 ％がタンパク質で、3000 種類以上が含まれています<ref>Omenn GS et al 2005 "Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: Results from the pilot phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups, generating a core dataset of 3020 proteins and a publicly-available database" ''Proteomics'' [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.200500358/pdf 5:3226-3245]</ref>。（血清は血液が凝固した後の水溶成分で、血液凝固因子が無く、血小板から出る成長因子を含む。）
 ;1 &sim; 10<sup>2</sup> mg/mL
@@ Line 107: / Line 107: @@
 # LC-MS で測定
-===タンパク質の定量法===
+===プロトアレイ===
 ;SILAC 相対定量法

@@ Line 2: / Line 2: @@
 プロテオミクスでは、細胞からのタンパク質抽出物をトリプシン等プロテアーゼで処理し、数十から数百万のペプチド断片に分解します。これを網羅的に計測するためには通常、超低流速LCを用います。
 ==超低流速LC==
@@ Line 33: / Line 57: @@
 ==タンパク質の測定==
 ===SRM, MRM===
-SRM は Selected Reaction Monitoring, MRM は Multiple Reaction Monitoring の略でともに同じ概念です。
+SRM は Selected Reaction Monitoring, MRM は Multiple Reaction Monitoring の略で、ともに同じ概念です。三連四重極質量分析計において測定する質量範囲を狭め感度を高める手法を指します。
-三連四重極質量分析計において測定する質量範囲を狭め感度を高める手法です。
 # 三つの四重極の一段目で、特定質量のペプチドだけを選択
 # 二段目で、アルゴンガスと衝突させ、MS<sup>2</sup>フラグメントを生成
 # 三段目で特定の断片化ペプチドだけを選択
-これには、あらかじめ測定する質量値を入力しておきます。この処理を複数のターゲットに対しておこなう場合は MRM と呼ばれます。
+これには、あらかじめ測定する質量値を入力しておきます。複数のターゲットに対して処理をおこなう場合が MRM です。
 ===リン酸化タンパク質の測定===

@@ Line 50: / Line 50: @@
 酸性タンパク質 < ヒドロキシ酸 < リン酸基
 </center>
-:となるためにリン酸化タンパク質を効率よく濃縮できます。これを Hydroxy-Acid modified MOC = HAMMOC 法といいます。
+:となるためにリン酸化タンパク質を効率よく濃縮できます。これを Hydroxy-Acid modified MOC = HAMMOC 法といいます。今は京都大学薬学部に所属する石濱さんが開発しました。
 ===細胞表面タンパク質の測定===

@@ Line 43: / Line 43: @@
 UniProtKBデータベースによると、2 万タンパク質のうち 6 千タンパク質がリン酸化されています。これらのリン酸化タンパク質は、いくつかの手法で濃縮することができます。
 * 3 価の金属イオン (Fe<sup>3+</sup>, Ga<sup>3+</sup> など) を用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography: IMAC)
-:: ただし金属イオンはペプチド表面にあるヒスチジンも捕らえるため、目標タンパク質の網羅性は下がります。
+:ただし金属イオンはペプチド表面にあるヒスチジンも捕らえるため、目標タンパク質の網羅性は下がります。
 * 酸化金属 (TiO<sub>2</sub>, ZrO<sub>2</sub>, Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>) などを用いた酸化金属クロマトグラフィー (MOC)
+:さらに、カラムと溶媒の両方にヒドロキシ酸<ref>TiO<sub>2</sub>には乳酸、ZrO<sub>2</sub>には3-ヒドロキシプロピオン酸を用います。</ref>を加えておくと、MOCの結合強度が
 さらに、カラムと溶媒の両方にヒドロキシ酸<ref>TiO<sub>2</sub>には乳酸、ZrO<sub>2</sub>には3-ヒドロキシプロピオン酸を用います。</ref>を加えておくと、MOCの結合強度が
 <center>
 酸性タンパク質 < ヒドロキシ酸 < リン酸基
 </center>
-となるためにリン酸化タンパク質を効率よく濃縮できます。これを Hydroxy-Acid modified MOC = HAMMOC 法といいます。
+:となるためにリン酸化タンパク質を効率よく濃縮できます。これを Hydroxy-Acid modified MOC = HAMMOC 法といいます。
 ===細胞表面タンパク質の測定===